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细胞透射电镜取材实验注意事项

1、细胞样品取材原则:

  细胞样品结构简单,一般分为悬浮培养及贴壁培养。贴壁培养建议使用6cm-10cm的培养皿培养,这样有足够的细胞量且方便操作。取材前,先查阅文献,明确实验目的,设计好实验流程,熟悉超微结构及分布,对需要观察的结构及特点需要有自己的判断,根据不同的实验目的,制定取材计划。另外,戊二醛会影响抗原活性,如果课题需要做免疫性的实验,取材时需要用不同的固定液固定。固定对取材用器材及试剂,进行清洁及预冷,写好取材的标签。取材时,务必做到相同条件下取材,相同人员平行操作。固定液一般为2.5%电镜专用戊二醛。

2、取材器材与试剂:

  冰盒、EP管、2.5%戊二醛、封口膜、吸管。均4度预冷备用。

3、细胞取材操作方法:

  3.1刮:将状态良好,处理完毕的细胞。连着培养液直接用细胞刮刀沿培养皿边缘由一个方向一次性刮下,不要反复来回刮,也不要用胰酶消化。反复来回刮会导致细胞损伤严重,结构被破坏。消化法更是会造成整体细胞结构改变,自噬假阳性、破坏细胞间紧密连接、线粒体损伤等。悬浮细胞可以理解为刮下的细胞悬液。

  3.2离:对细胞状态,观察的结构及过程要有大概了解。常规自噬、线粒体等观察直接刮下后转移到15ml离心管中,1000-3000rpm低速离心,目的是富集细胞。转速越低越好,时间越短越好。期间对于凋亡、坏死等实验,取材时,需要将细胞上清中漂浮的细胞或碎片收集。很有可能这些漂浮的细胞及碎片是凋亡、坏死程度较高,超微结构最为典型的。

  3.3洗:刮下细胞后,需要用PBS将细胞洗2次,主要目的是去除残留的培养基,提高成像效果,但这个过程不是必须的。在这个过程中,细胞处于饥饿状态,操作一定要迅速,对于敏感的细胞(神经元、心肌细胞等),可以不洗。否则会导致结构改变。

  3.4:全程4℃操作保存送样。尽量在低温下操作,降低水解酶的活性,所用容器和器械应预冷,取好的标本放在4冰箱保存。