细胞透射电镜取材实验注意事项

1、细胞样品取材原则：

  细胞样品结构简单，一般分为悬浮培养及贴壁培养。贴壁培养建议使用6cm-10cm的培养皿培养，这样有足够的细胞量且方便操作。取材前，先查阅文献，明确实验目的，设计好实验流程，熟悉超微结构及分布，对需要观察的结构及特点需要有自己的判断，根据不同的实验目的，制定取材计划。另外，戊二醛会影响抗原活性，如果课题需要做免疫性的实验，取材时需要用不同的固定液固定。固定对取材用器材及试剂，进行清洁及预冷，写好取材的标签。取材时，务必做到相同条件下取材，相同人员平行操作。固定液一般为2.5%电镜专用戊二醛。

2、取材器材与试剂：

  冰盒、EP管、2.5%戊二醛、封口膜、吸管。均4度预冷备用。

3、细胞取材操作方法：

  3.1刮:将状态良好，处理完毕的细胞。连着培养液直接用细胞刮刀沿培养皿边缘由一个方向一次性刮下，不要反复来回刮，也不要用胰酶消化。反复来回刮会导致细胞损伤严重，结构被破坏。消化法更是会造成整体细胞结构改变，自噬假阳性、破坏细胞间紧密连接、线粒体损伤等。悬浮细胞可以理解为刮下的细胞悬液。

  3.2离：对细胞状态，观察的结构及过程要有大概了解。常规自噬、线粒体等观察直接刮下后转移到15ml离心管中，1000-3000rpm低速离心，目的是富集细胞。转速越低越好，时间越短越好。期间对于凋亡、坏死等实验，取材时，需要将细胞上清中漂浮的细胞或碎片收集。很有可能这些漂浮的细胞及碎片是凋亡、坏死程度较高，超微结构最为典型的。

  3.3洗:刮下细胞后，需要用PBS将细胞洗2次，主要目的是去除残留的培养基，提高成像效果，但这个过程不是必须的。在这个过程中，细胞处于饥饿状态，操作一定要迅速，对于敏感的细胞（神经元、心肌细胞等），可以不洗。否则会导致结构改变。

  3.4冷:全程4℃操作、保存、送样。尽量在低温下操作，降低水解酶的活性，所用容器和器械应预冷，取好的标本放在4℃冰箱保存。