肺组织透射电镜取材注意事项

1、肺组织取材原则：

  肺组织结构较为简单，取材前，先查阅文献，明确实验目的，设计好实验流程，熟悉组织结构及分布，对需要观察的结构需要有组织学位置判断。另外，戊二醛会影响抗原活性，如果课题需要做免疫性的实验，取材时需要用不同的固定液固定。肺组织尽量灌注取材，灌注时请一定保证灌注充分，灌注不充分效果会远低于不灌注。对于未进行灌流固定的动物最好先进行电镜标本的取材，以免组织自溶，影响超微结构的观察。对取材用器材及试剂，进行清洁及预冷，写好取材的标签。取材时，务必做到相同条件下取材，相同人员平行操作。固定液一般为2.5%电镜专用戊二醛，灌流固定选用3%多聚甲醛1%戊二醛。

2、取材器材与试剂：

  冰盒、手术刀、手术剪、剃须刀片、EP管、2.5%戊二醛、蜡盘（光盘、载玻片均可）、封口膜、吸管、注射器。均4度预冷备用。

3、取材流程（不灌注取材）：

 3.1、取材基本要点：

  小:没有方向的组织取材尺寸为1mm×1mm×1mm，有方向的组织为1mm×1mm×3mm为宜，3mm为长轴的方向。因为固定液的穿透能力只有0.5mm，若样品过大会使内部固定不良；样品过小时观察的目标将受到局限。

  轻:取材刀片要锋利，一般用剃须刀片，操作应始终贯彻动作轻柔。只做直线切割，避免对组织的挤压及拉锯，以免引起人工损伤。

  准:电镜视野非常窄，所以取材的部位一定要准确可靠，根据研究目的要考虑到定位和定向的问题。

  冷:4℃操作、保存、送样。尽量在低温下操作，降低水解酶的活性，所用容器和器械应预冷，取好的标本放在4℃冰箱保存。

 3.2、肺组织取材具体操作：

  实验动物麻醉、灌流充分，然后用粗的剪刀将动物断头,左手捏住大鼠两耳,右手持剪刀剪开胸腔，取出肺组织，用锋利的刀片切下一块肺组织置于滴有预冷固定液的蜡板上,切成1立方毫米小块每组3-5块。肺泡中通常含有大量空气，会造成组织漂浮，固定不充分。可以用载玻片轻压组织，排出空气。（此步操作有可能会导致结构损伤，也可以用取材后抽气代替）然后将切成1立方毫米小块每组3-5块。最后用牙签将组织块逐一放入盛满固定液的EP管中。如果组织块依然漂浮在固定液表面，可用纱布将组织块压到液面以下。最后将样品管放入4℃冰箱，固定2～4h后邮寄。邮寄时固定液充满EP管，封口膜封口，气泡膜或报纸包裹厚一些。最后泡沫盒+冰袋的方式运输，冰袋2-3个（-20℃冰袋，多了会冻坏样品），一定要与样品隔开。

灌注取材较为费时费力。肺组织也可以不灌注取材。流程为：实验动物麻醉，然后用粗的剪刀将动物断头,左手捏住大鼠两耳,右手持剪刀剪开胸腔，迅速将预冷的2.5%戊二醛注射到需要观测的肺组织处。然后迅速用锋利的刀片切下注射过戊二醛的组织并置于滴有预冷固定液的蜡板上,肺泡中通常含有大量空气，会造成组织漂浮，固定不充分。可以用载玻片轻压组织，排出空气。（此步操作有可能会导致结构损伤，也可以用取材后抽气代替）然后将切成1立方毫米小块每组3-5块。最后用牙签将组织块逐一放入盛满固定液的EP管中。如果组织块依然漂浮在固定液表面，可用纱布将组织块压到液面以下。最后将样品管放入4℃冰箱，固定2～4h后邮寄。邮寄时固定液充满EP管，封口膜封口，气泡膜或报纸包裹厚一些。最后泡沫盒+冰袋的方式运输，冰袋2-3个（-20℃冰袋，多了会冻坏样品），一定要与样品隔开。