冷冻电镜样品制备常规方法

　　在低温下用透射电子显微镜观察样品的显微技术叫冷冻电镜技术。当用户拍摄获得样品颗粒的足够多数量的高质量电镜照片后，即可由计算机三维重构技术解析得到样品颗粒的三维结构。自从前几年冷冻电镜技术突破（直接电子检测器、图像漂移校正、三维重构技术等）后，冷冻电镜技术已成为结构生物学领域重要的结构解析技术，它特别适合用于解析一些大分子量的、难以结晶的生物大分子结构。且最近几年，冷冻电镜解析得到的生物分子的结构分辨率已可达到原子级分辨率，它已成为一种和X-射线晶体学技术互补的重要的生物大分子结构解析技术。

　　冷冻电镜实验的第一步为冷冻电镜样品制备实验，它是将溶液状态下的样品铺展在铜网上，形成很薄的样品液层（液层厚度取决于样品颗粒大小），然后再将铜网投入液态乙烷中进行快速冷冻。快速冷冻后的样品将转变成无定型状态的冰（玻璃态的样品），该状态下的样品中不含有冰晶，不会破坏生物样品本身的结构，也不会导致电子衍射干扰数据收集。快速冷冻后的样品对透射电镜中的电子辐射耐受能力大大提高，且冷冻后的样品颗粒呈现的是样品自然状态下的形貌。

　　冷冻电镜玻璃态样品制备

　　上图为冷冻电镜玻璃态样品制备的示意图。首先我们选择一张铜网作为冷冻电镜观察的载网，铜网一般为三层结构，由铜网骨架、方华膜和含有微米级小孔的碳膜组成。接着我们把待测试样品溶液滴在铜网上。一般来说，滴在铜网上的样品体积为3-5μL，样品上了铜网后会铺展开来，不过此时铜网上的样品液层厚度太厚，如果直接冷冻，冷冻剂很难将其冻透成玻璃态的样品，上了电镜后，也会因为电子束无法穿透厚厚的样品，从而看到漆黑的一片。因此，在进行快速冷冻前我们必须把铜网上多余的样品给去除，常规方法为使用滤纸吸去多余的样品，仅在铜网上留下一层非常薄的液体。通常来说，这层液体的厚度略大于样品颗粒的尺寸，常在纳米级。如何控制实验的变量，从而保证超薄液层制备成功，这就变成非常难又比较随机的事情了。

　　冷冻电镜铜网的结构及样品在碳膜小孔中的分布

　　镶嵌于铜网碳膜小孔内玻璃态样品中的转铁蛋白颗粒

　　当完成铜网上超薄样品液层的制备后，我们需要将铜网快速投入到液态乙烷中完成样品的快速冷冻。为什么要选择液态乙烷作为冷冻剂呢？这是因为液态乙烷有着非常大的导热速率，能够在极短时间内将样品溶液的温度降低到玻璃态温度，实现玻璃态样品的制备。在完成玻璃态样品制备后，我们可以将铜网由液态乙烷内转移到液氮中进行储存，玻璃态的样品在液氮的低温中依旧能保持稳定存在，且方便进行样品的长期储存和运输。

　　单颗粒冷冻电镜技术介绍

　　通常来讲，冷冻电镜样品制备实验需要考虑到的参数有：环境湿度、环境温度、滤纸按压的时间和力度。制样时的环境温度将影响我们的生物样品的稳定性，滤纸作为铜网上样品减薄的工具，其按压铜网的力度和时间非常影响样品在铜网上的厚度。此外，为避免超薄样品的蒸发，100%的制样湿度也必不可少。当前冷冻电镜样品制备装置可分为手动制样装置和自动化制样机器人。

　　下图展示了一种手动制样装置。手动制样装置结构简单，通常含有一个可上下往复运动的轴（通常为压缩空气驱动），用于带动镊子的上下运动，从而实现将铜网投入装置下方装有冷冻剂的杜瓦中。铜网上多余的样品的吸除也是依靠滤纸按压来完成，因为是手动完成的操作，所以实验的重现性很差，不能保证每次做出来的结果都相同。

　　一种手动的冷冻电镜制样装置

　　目前主流的冷冻电镜样品制备方法是依靠自动化的制样机器人来完成的，如下图所示。这类机器人都具有一个密闭的制样室，用于提供一个温度和湿度可控的制样环境。其样品减薄依然是采用滤纸按压的方式来实现的。机器人还有一个机械臂（轴），可以悬挂镊子，在电机的驱动下，可以高速将镊子尖端插入冷冻剂中。其主要的制样流程是：先设置好制样室的湿度和温度，使得我们的样品可以维持稳定；设置好制样参数，如滤纸按压的时间和力度，等待时间等；然后将夹有铜网的镊子安装到机器人的机械臂上，使得铜网处于制样室内；用移液枪将3-5μL样品注射到铜网上，后续的实验操作（滤纸按压、铜网的冷冻）机器人将按照预先设定的程序自动完成。用机器人进行实验可获得较好的重现性，因此目前各大冷冻电镜中心都采用制样机器人来进行实验。

　　总的来说，自动化的冷冻电镜机器人缩短了冷冻电镜样品制备的耗时，在一定程度上提升了冷冻电镜样品制备实验的重现性，但其仍存在一些缺点。如，铜网上几乎99%的样品在制样过程中被滤纸吸走，存在样品浪费的情况；用滤纸按压实现样品减薄在很大程度上难以控制，制样实验需摸索的参数较多，样品液层厚度不可控。