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Q:见外泌体来源类型样本的收集方法

时间:2021-09-01     

  俗语说,良好的开端是成功的一半,领先一步,占尽先机!对于外泌体研究,一步也是相当重要的一步就是收集制备外泌体样本,那么如何有效地收集各种类型的样本用于后续的外泌体分离呢?关于不同的试验、不同的样品,取样的注意事项有哪些呢?又需要经过哪些预处理才能保存呢?下面小编将与大家一起来探讨上述介绍的最常见外泌体来源类型样本的收集方法。


  01.细胞上清Cell culture supernatant--关于细胞培养上清液,首先需要确定的是细胞的身份验证以及支原体与微生物污染。国际细胞外囊泡协会于2018年在会刊Journal of Extracellular Vesicles发表了新版的《指导要求》,即《MISEV 2018》(下载全文)。在描述收集和预处理过程中需要注意的可控变量中,注明所有细胞研究都建议采取一些预防措施,如定期确认细胞身份(短串联重复序列STR分析或其他方法),鉴定细胞品系和来源。另外需要定期检测支原体、微生物污染,不仅因为污染对细胞的影响,还有污染物也会分泌细胞外囊泡(详细信息查阅:外泌体研究之细胞鉴定)。


  另外需要注意的是:细胞培养基必须使用去除exosome的血清(如去外泌体胎牛血清,Exosome depleted Fetal Bovine Serum,VivaCell P/N:C38010050)或者无血清培养基,以降低背景值的干扰(牛血清中含有大量牛源外泌体)。

外泌体检测

  1)细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间,细胞增长至约70%;


  2)对于贴壁细胞,去除原有培养基,用PBS洗涤,更换新的含去外泌体血清的培养基或者无血清培养基;对于悬浮细胞,300×g,4℃,10分钟收集细胞,用PBS洗涤,使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养;


  3)细胞继续培养24-48小时,根据细胞的生长速度确定收取上清时间;


  4)收集细胞上清,300×g,4℃,离心10分钟;小心吸取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片;


  5)上清0.22μm过滤,去除细胞碎片、凋亡小体和微囊泡;


  6)将上清样本冻存于-80℃。


  建议送样量:20ml以上


  02血浆Plasma


  1)取全血至EDTA抗凝管中,轻柔混匀;


  2)4°C条件下,2500×g,离心15min,取上清;


  3)再次2500×g,离心15min,取上清即为血浆;


  4)血浆于-80°C保存。


  建议送样量:2ml以上


  03血清Serum


  1)将4ml全血置于普通采血管中(注意收集血清样本不要加入抗凝剂)37℃凝固20-30 min;


  2)2000×g离心10 min,取上清,淡黄色透明液体即为血清;


  3)将血清置于-80°C保存。


  建议送样量:2ml以上


  04尿液Urine


  1)无菌容器收集清晨第一次尿液50ml;


  2)加入蛋白酶抑制剂混合物(1.67 ml of100mM NaN3,2.5ml PMSF(2 mg/ml in isopropyl alcohol),50μl Leupeptin(1 mg/ml in ddH2O));


  3)立即处理或置于-80°C保存。


  建议送样量:20ml以上


  05脑脊液Cerebrospinal fluid


  1)收集脑脊液,放置冰上静置30min;


  2)4℃,2000×g,离心10分钟,去除细胞或细胞碎;


  3)取上清,立即处理或置于-80°C保存。


  建议送样量:10ml以上


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