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外泌体NTA结果怎么看?外泌体检测

  外泌体NTA结果怎么看?外泌体参与神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程,同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景,由于它们含有丰富的生物标志物,可用于监测疾病进展,治疗反应等,同时由于外泌体具有携带递送生物分子的功能,具有成为临床药物递送载体的潜力。外泌体的功能研究一步,即进行外泌体的鉴定。

  外泌体是由细胞分泌的直径在30~150nm的膜性小囊泡,那么是否存在直径大于150nm或与外泌体大小相近的其它膜性小囊泡呢?答案是肯定的。这里就要说到细胞外囊泡(EVs),EVs是由细胞释放的膜性小囊泡,直径在30nm到9μm之间,根据直径的大小,可细分为三大类:外泌体(30~150nm)、微囊泡(100-1000nm)和凋亡小体(50-2000nm)。

  国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年提议,对于分离获得的外泌体需要从三个层面进行鉴定:(1)Western Blot(WB)鉴定外泌体表面标志物;(2)透射电镜(TEM)鉴定外泌体形态;(3)粒径分析(NTA)鉴定外泌体大小。


  01.WB验证:检测外泌体标志蛋白的表达情况

  鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在于样品中,外泌体形成于早期胞内体,在内吞体转运复合体(ESCRT)及一些相关蛋白的调控下,早期胞内体发生内出芽形成多个腔内小囊泡,构成多胞体(MVB),MVB最后在GTPase家族中的RAB酶调解下与细胞膜融合向外界释放囊泡。

  外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63、CD81和CD9))、热休克蛋白家族((HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33(结肠上皮细胞来源)、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素(不成熟的树突状细胞)。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等,是最常用到的细胞外囊泡标志物。

  这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程,他们产生于细胞中,定位于胞内的膜结构附近,如四旋蛋白(CD9,CD63和CD81),直接参与了细胞外囊泡内容物的分选;TSG101是ESCRT复合体相关的蛋白,而ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的过程。


  02电镜:分析外泌体的大小/形态等

  扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)或透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)等电子显微镜可用于外泌体鉴定。SEM的工作原理是用能量为1~30 KV间的电子束,以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上,利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成像,获得试样表面微观组织结构和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技术的发展,场发射电子枪的应用得到普及,现代先进的SEM的分辨率已经达到1 nm左右,足够用来进行外泌体尺寸的测量。TEM是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上,电子与样品中的原子碰撞而改变方向,从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关,因此可以形成明暗不同的影像,影像放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、感光耦合组件)上显示出来。

  操作步骤大致是:

  用PBS重悬提取的外泌体,滴于孔径2 nm的载样铜网上,室温静置2 min,用滤纸从滤网侧边吸干液体,用3%磷钨酸溶液在室温下负染5 min,滤纸吸干负染液,室温晾干,电镜观察拍照。外泌体在电镜下具有非常明显的膜边界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯状结构(也会有200 nm以下、较难鉴别的其他形状的外泌体),但电镜对样品的预处理和制备要求较高,样品分离方法和样品性质可能影响电镜结果的好坏;样品的准备阶段比较复杂,不适合对外泌体进行大量快速的测量;且因外泌体经过了预处理和制备过程,无法准确测量。

  以上两种方法是最常用的外泌体的鉴定方法,是展开外泌体功能研究的前提。比如在肿瘤研究中,通过提取鉴定不同细胞系中的外泌体,进而通过PCR以及测序筛选分析RNA,探究外泌体在肿瘤进展或者耐药中的发生机制。

  外泌体像一把“双刃剑”,与癌症进展有着密切的联系,参与促进癌细胞的增殖与扩散,对癌症的发生及恶化有着重要的作用。但外泌体又可以应用于癌症的诊断与治疗,目前外泌体在癌症诊断与治疗中的应用尚处于初级阶段,未来仍需要对外泌体的作用进行更深入地探究,使其更好地应用于临床。

外泌体NTA

  03纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体粒径及浓度

  在外泌体研究领域,NTA技术已被用作外泌体表征手段之一;相较于其他表征方式,NTA技术的样本处理更简单,更能保证外泌体原始状态,检测速度更快。大致方法是:将收集的外泌体用PBS稀释至106/mL,用1 mL注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪(如装有450 nm激光器的Nanosight NS300颗粒粒度分析仪);激光光束穿过样本室外泌体颗粒,通过装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化,捕捉外泌体的布朗运动,利用爱因斯坦方程式根据其运动计算浓度和流体力学直径。SBI公司新开发的一种排除非外泌体颗粒干扰的试剂盒,还可帮助实现对完整外泌体的NTA分析。


  04.流式细胞仪检测外泌体的生物标志物

  流式细胞仪检测技术比较快速,适合高通量筛选,且可分析颗粒的大小与体积。用外泌体表面特异性标志物相应的抗体进行标记,用流式细胞仪检测其阳性表达,从而验证外泌体。如染色后的外泌体溶液加入分支聚乙烯亚胺(PEI),37oC孵育15 min,之后超速离心去除PEI,然后加入金纳米颗粒,轻柔重悬后置于培养箱中60 min,加入别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)DNA染料,室温孵育15 min后流式细胞仪检测。APC阳性的颗粒即为所需检测的外泌体。