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Biosens & Bioelectron:基于球形核酸级联信号放大策略的高灵敏外泌体检测方法

  大量研究证实,肿瘤细胞衍生的外泌体参与癌症的发生、发展和转移过程,能够反映相关癌症信息。由于外泌体检测在体液中分布广泛,取样过程创面小,因此被作为一种可靠的非入侵式生物标志物用于肿瘤的诊断和疗效评估。传统的外泌体检测分析方法,如ELISA,western blotting,以及纳米示踪技术(nanoparticle tracking analysis,NTA),存在着样品需求量大、制备过程耗时以及灵敏度低等缺点。为克服这些不足,许多技术如表面等离子共振(SPR),表面增强拉曼散射(SERS)、流式细胞术、微流控等被发展出来用于提高外泌体检测的灵敏度。然而,这些技术往往需要借助较为昂贵的仪器设备和复杂的表面修饰过程,不利于外泌体的高通量分析需求。因此,发展更易操作且灵敏度更高的方法用于外泌体的检测分析具有重要的实际意义。


  近期,南京大学生科院李根喜教授课题组与南京医科大学第二附属医院肿瘤中心主任王朝霞教授课题组合作,通过在外泌体上设计球形核酸,提出了一种新的级联信号扩增策略用于高灵敏外泌体检测。相关成果以Spherical nucleic acids-based cascade signal amplification forhighly sensitive detection of exosomes为题发表在国际著名学术期刊Biosensorsand Bioelectronics(2021,1;191:113465)上,博士研究生王磊为论文第一作者,李根喜教授和王朝霞教授为论文共同通讯作者。研究工作得到了国家自然科学基金以及南京大学优秀博士研究生计划项目的资助。


  球形核酸(spherical nucleic acids,SNAs)是一种以球形纳米材料为支点而修饰的一层致密且高度定向的核酸,其空间定性特性使得球形核酸和配体具有更高的亲和力。合成球形核酸的材料通常有金属纳米颗粒、配位聚合物材料、微粒体和脂质体等。与脂质体类似,外泌体也是一层由脂质双层膜包裹的囊泡结构且能够进行膜表面修饰。由于磷脂双分子层膜的疏水性,胆固醇分子能够通过疏水作用力简单快速地与生物膜结合。基于此,研究人员设计将外泌体作为一个核心模板结合胆固醇修饰的DNA以形成球形核酸,并以此用于外泌体的检测分析。


  

外泌体检测

图1:基于球形核酸的级联信号放大策略用于电化学检测外泌体的示意图


  如图1所示,研究人员首先通过磁珠上修饰的适配体特异性捕获外泌体。接着,5’端修饰胆固醇的核酸引物链基于疏水作用力与外泌体膜结合,并以此形成以外泌体为核心的球形核酸。该球形核酸的3’端自由基能够被脱氧核糖末端转移酶(TdT)识别并延伸成polyT长链。磁分离后,含有polyA的探针A能够与polyT互补配对,并在核酸外切酶III(ExoIII)作用下切割探针A,形成短链核酸。该短链核酸又能被TdT延伸以及作为模板切割探针A。本设计中的探针A的5’端修饰亚甲基蓝分子用于产生电信号输出,3’端修饰双脱氧胞嘧啶用于防止探针A被TdT延长。当体系中的探针A被大量切割后,结合到电极上的电信号分子则很少,最终产生很低的电化学信号。反之,当体系中没有目标外泌体时,以上反应便不能发生,即会产生很高的电信号输出。


  在该方法设计中有三重信号放大:1)一个外泌体上能够结合许多引物链形成球形核酸;2)一条引物链被TdT酶延长所形成的模板切割大量的探针A;3)被切割后形成的探针A短链作为新的引物循环第二重信号放大过程。因此,整个检测过程无需复杂的核酸序列设计,便可获得对外泌体的高灵敏检测。此外,分析比较外泌体上EpCAM膜蛋白含量能够区分不同肿瘤细胞外泌体。实验中设计的特异性识别过程和简易的磁珠分离操作能在复杂的生物样品中展现较好的分析性能。通过分析临床实际样本中的外泌体,该方法能够区分恶性结直肠癌患者和健康对照,为其应用于癌症诊断提供了可能。


  李根喜教授课题组长期从事生物分子工程及临床检验应用方面的研究工作,在基于生物传感的分子诊断技术研究方面取得了系列研究成果,近几年针对外泌体分析新方法研究开展了一些工作,如基于外泌体膜上的磷酸结构与锆的配位作用(Chem.Commun.,2019,55:2708-2711;Anal.Chem.,2020,92:3819-3826),借助外泌体纳米结构的空间位阻效应(ACS Appl.Mater.Interfaces,2020,12:322-329;Chem.Commun.,2020,56:13768-13771),通过酶信号扩增(Chem.Commun.,2021,57:8508-8511),或者使用共价有机框架材料(Biosensors and Bioelectronics,2020,169:112638)以及pH试纸(Talanta,2019,192:325-33)等尝试了多种外泌体分析检测新方法。鉴于该课题组在这些方面开展了一些研究工作,Frontiers of Medicine邀请该课题组以Biosensor-basedassay of exosome biomarker for early diagnosis of cancer为题撰写了综述,该文章已在线发表(https://doi.org/10.1007/s11684-021-0884-z),并且出版社和期刊社已授权开放获取。


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