透射电镜取材全攻略：生物样品的注意事项

生物样品的取材与固定是生物电镜技术中zui关键的一步，样品的质量直接决定了电镜数据的质量。取材导致的结构差，后期实验中无法补救。

基本要求：确保样品尽可能接近样品原始状态，同时确保位置准确。不同的样品，取材细节上有较大区别，有任何疑问，请关注公众号与我们技术老师联系，指导详细取材！

试剂耗材：2.5%电镜专用戊二醛、PBS或生理盐水、锋利的手术刀、镊子、牙签、吸管、封口膜、细胞刮、离心机、切割板（光盘或塑料盘）、0℃碎冰（不要冰袋）、1.5ml尖头ep管、铅笔、记号笔。

一、动物组织取材流程及要求

取材流程：（1-3min之内取材完毕）

1.试剂、容器、器械4℃预冷，取材冰上操作（0℃碎冰，不要冻存的冰袋）。提前滴一些2.5%戊二醛在切割板上；

2.动物麻醉/处死，快速打开需要取材的位置。趁血液还在流动时，迅速切取一块组织，生理盐水或PBS快速冲洗后浸泡到切割板上的戊二醛中进一步切割；

有方向性的样品：如肌丝、脊髓、肠道、血管等，沿着组织伸展方向切成1mm*1mm*3mm的长条，以便分辨方向。

薄片状样品：如视网膜、粘膜等可以切的大一些3mm*3mm左右。

无方向性的样品：选择位置准确的部位切成1mm³小块，切记宁缺毋滥，保证取的每一块都是准确的。如：观察肾小球取肾皮质，观察肺泡避开气管取肺叶。

有被膜的样品：去除被膜或者将被膜破孔方便渗透。样品大小尽量接近，不规则或稍大一点没关系。一定要避免修整样品时造成边缘组织机械损伤，这样反而效果不好。

切的时候避免刀片对样品的挤压，应该拉刀法（斜着前后拉动手术刀）切断，切样时，配合牙签轻轻拨动样品，将样品切成符合要求的形状。疏松多孔及柔软的样品可以大一些，避免样品溶解或压坏。最后将样品用沾水的牙签粘入1.5ml尖头EP管。不要用镊子夹样品。加满2.5%戊二醛。4℃避光保存。如果样品漂浮，可用纸或纱布将组织压到液面以下。

取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触，防冻伤。

注意事项：

1.组间位置一致。同一器官不同部位的同种细胞，结构也有较大差异；

2.器具锋利，柔软的组织要用手术刀轻轻拉断，尽量避免压断，保证切面锋利。

3.冰上操作时，用制冰机的碎冰，如果没有碎冰，可以室温取材，冰袋易冻伤样品。

4.取材速度，条件是灵活的，把握整体原理，不要刻意为了保证位置或大小，切坏了样品。尤其是要避免样品挤压以及冰袋冻坏样品。

关于灌注取材：

灌注取材要求较高，经验不足或条件不足尽量不要灌注。灌注不充分时，反而会导致超微结构较差。较大且组织深度较深，不好定位的组织，可以选择灌注。要求如下：

1.灌注液建议：终浓度为4%多聚甲醛+1%戊二醛混合液，稀释液为PB（试剂配方参考附件）；

2.多聚甲醛和戊二醛均为电镜专用，多聚甲醛建议新鲜配置7天以内的；                         

3.灌注方式以机械泵辅助灌注，尽量灌注充分。灌注不充分会导致部分区域结构差。                       

4.灌注完成之后，按上述要求电镜取材，样品固定在2.5%戊二醛中，4度邮寄给我们。较大且较深的组织，振动切片成150-200um的厚片固定，方便后续操作。

二、细胞细菌取材流程及要求

贴壁细胞取材流程：细胞取材有2种方法，分别为刮取法和消化法。均有各自的优缺点，请根据情况酌情取材。

刮取法操作流程：

1.请用6cm-10cm的培养皿培养细胞，方便后续操作；

2.细胞倒掉培养液，加入恢复至室温的戊二醛固定液2ml。

3.细胞常温避光固定5min后，用细胞刮刀斜45°朝一个方向快速铲下，保持一个方向，不要来回刮；

4.得到的细胞悬液吸入离心管，离心（1500-3000rpm）3-5min，弃上清，然后加入新的戊二醛固定液。再次更换固定液后，室温避光固定30min后，4℃保存。细胞团块需要有绿豆大小，如图所示。太大的团块建议吹散重悬。

5.取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触，防冻伤。

消化法特点操作流程：

1.培养好的细胞（细胞密度不超过70%）弃培养基，加入胰酶消化。

2.胰酶消化好后（时间不宜过长），加培养基终止消化，吸管轻轻吹打至细胞起浮。吸入离心管，低速离心（1500-3000rpm），3-5min左右，细胞团要有绿豆大小，如图所示。

3.弃上清，加入戊二醛固定液（室温），细胞量多需要吹散，少量细胞无需吹散。

4.室温避光固定30min，再转移至4°保存运输。

5.取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触，防冻伤。

悬浮细胞取材流程：

细胞悬液离心（1500-3000rpm）3-5min，弃掉培养基后加入2.5%戊二醛室温避光固定30min，再转入4℃保存，4℃冰袋运输。细胞团块需要有绿豆大小，如图所示。太大的团块可用牙签挑成几块。取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触，防冻伤。

细菌取材流程：

1.固定培养的细菌：牙签挑取菌落置于室温2.5%戊二醛，避光固定30min。再转入4℃保存，4℃冰袋运输。样品包裹厚一点，不要和冰袋直接接触，以免冻伤。细胞团块需要有绿豆大小，如图所示。太大的团块可用牙签挑成几块。

2.悬浮细菌：细菌悬液离心（5000-10000rpm）3-5min，弃掉培养基后加入2.5%戊二醛室温避光固定30min，再转入4℃保存。细胞团块需要有绿豆大小，如图所示。4℃冰袋运输。取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触，防冻伤。

注意事项：

1.不要反复来回刮细胞，会造成细胞大量损伤；

2.离心的目的是让细胞聚集成团，转速不可太高，会导致细胞变形；

3.样品保存邮寄时，避免冻伤。

三、外泌体、噬菌体、病毒、脂质体等：

1.建议提供浓缩液至少50ul，样品的纯度及浓度尽量高。

2.保存及运输方式以样品结构性状稳定为要点。如：冻存的外泌体及病毒，不好反复冻融，所以建议干冰邮寄。新鲜提取的外泌体及噬菌体等，4℃可存放3-5天，所以样品可冰袋邮寄。部分样品可能在常温更能稳定保存其形态，即可常温邮寄。

3.取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。

四、植物组织取材及要求

取材流程：

1.PBS冲洗样品表面，去除泥沙等污染物。

2.用锋利的手术刀或剪刀切割样品，切样时，可配合牙签轻轻拨动样品，将样品切成符合要求的形状；

有方向的样品：如根尖、茎等，沿着组织伸展方向切成1mm*1mm*3mm的长条，以便分辨方向；

薄片状样品可以切的大一些3mm*3mm左右；

没有方向的样品切成1mm³小块，切记宁缺毋滥，保证取的每一块都是准确的，如观察果皮就要去除果肉。观察果肉就要去除果皮。观察叶片就需要避开叶脉。有膜壳的样品要去除膜壳或者将膜壳破孔方便渗透；

1.注意切割边缘整齐，去除机械损伤的位置。

2.最后将样品用沾水的牙签沾入1.5ml尖头EP管。加满2.5%戊二醛。4℃避光保存。不要用镊子夹样品。如果样品漂浮，可用纸或纱布将组织压到液面以下。如果需要抽气，注意抽气的程度，太强烈可能会导致结构变化。

3.取好的样品封口膜封口，气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触，防冻伤。

注意事项：

1.组间位置一致。同一器官不同部位的同种细胞，结构也有较大差异；

2.样品大小尽量接近，不规则或稍大一点没关系。

3.器具锋利，柔软的组织要用手术刀轻轻拉断，尽量避免压断，保证切面锋利。一定要避免修整样品时造成边缘组织机械损伤，这样反而效果不好。

4.冰上操作时，用制冰机的碎冰，如果没有碎冰，可以室温取材，冰袋易冻伤样品。

5.取材速度，条件是灵活的，把握整体原理，不要刻意为了保证位置或大小，切坏了样品。尤其是样品挤压以及冰袋冻坏样品。

五、样本储存运输标准

储存：样本取材后，4℃避光保存时间最好不超过1个月。

运输：固定液充满EP管，封口膜封口。如下图，气泡膜或报纸包裹7-8层。纸质送样单+泡沫盒+冰袋的方式运输，冰袋2-3个（-20℃冰袋，不要太多，夏季3-4个），顺丰寄付。