5kg黄芪外泌体提取及冻干操作步骤详解

一、材料准备

1. 黄芪样本：取新鲜的5kg黄芪组织，将样品清洗干净，使用无菌剪刀将组织裁剪合适大小。

2. 提取试剂：PBS缓冲液、超速离心管、0.45μm滤器、外泌体提取试剂盒、酶解液。

3. 仪器设备：破壁机、压榨机、冷冻干燥机、电子天平、移液器等。

二、黄芪外泌体提取步骤

1. 黄芪粗提溶液制备

• 将洗净的黄芪样本放置于破壁机中进行组织破壁。

• 加入适量酶解溶液，过夜酶解后取出。

• 酶解后的溶液倒入滤袋中，进行过滤；打包好滤袋后盖子放下去通过液压器进行二次压榨，获得提取液。

• 通过0.45μm滤器过滤，去除大颗粒杂质，得到澄清的黄芪液。

2. 沉淀试剂分离

• 使用高速速离心机进行梯度离心：

• 第一阶段：4℃条件下，以300g离心10分钟，去除细胞。

• 第二阶段：4℃条件下，以3000g离心10分钟，去除细胞碎片和细胞器。

• 第三阶段：4℃条件下，以10000g离心30分钟，进一步去除大颗粒杂质。

• 上清加入沉淀试剂过夜。

• 4℃条件下，以10000g离心60分钟。
  

• 离心完成后，小心吸弃上清液，保留离心管底部的沉淀物（即初步分离的外泌体）。

3. 外泌体纯化

• 加入100ml PBS缓冲液（通常为沉淀物体积的5-10倍），轻轻吹打混匀，使外泌体重新悬浮。

• 再次以10000g离心1小时，去除残留的杂质和未完全沉淀的颗粒。

• 离心完成后，吸弃上清液，得到纯化的外泌体沉淀。

• 纯化的外泌体进行过滤除菌

• 除菌后外泌体进行无菌分装与冻干前准备

  
  

  
  

4. 外泌体浓缩与保存

• 使用冷冻干燥机将纯化的外泌体沉淀进行冷冻干燥，得到外泌体干粉。

• 将外泌体干粉置于-80℃冰箱中保存，避免反复冻融。

三、注意事项

1. NTA检测结果

2.TEM检测结果

典型外泌体结构

四、常见问题解答

1. 样本处理：黄芪样本应新鲜且无污染，避免使用霉变或变质的样本，以免影响外泌体提取效果。

2. 离心条件：超速离心时，需严格控制离心速度和时间，避免离心速度过高或时间过长导致外泌体结构破坏。

3. 试剂选择：外泌体提取试剂盒应选择适合大体积样本的型号，以提高提取效率。

4. 操作规范：在操作过程中，需保持实验台面清洁，避免交叉污染；同时，使用一次性移液器吸头，避免试剂污染。

五、结语